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相差光学显微镜诊断支原体可靠吗?

  当临床医师怀疑病人患有微生物引起的感染性疾病时,经常要做病原学检验。方法之一是取患处分泌物或组织,制成标本或涂片,经染色或不染色,在显微镜下查找病原微生物。结核杆菌、真菌孢子、寄生虫等较大的微生物均可采用这种方法检验。衣原体和病毒颗粒一般小于0.2μm,我们不能在光学显微镜下分辨出来,要经特殊处理,在电子显微镜下观察它们的特征。支原体小于细菌又大于病毒,那么,能否将病人患处分泌物制成涂片,在相差光学显微镜下加上电子放大,将图像放大后,在显视屏幕上直接观察活的支原体个体,做出病原学诊断呢?要回答这个题目,要从三方面分析:
  
  支原体的形态特征
  
  支原体是没有胞壁的原核微生物,由于缺乏胞壁,菌体有一定可塑性,形态呈多形性变化。由于寄宿细胞或体外培养条件不同,繁殖期不同,菌体大小和形态也各异。在体外适宜培养条件下,菌体通常呈细丝状、螺旋丝状或球菌状等。菌体大小、形态也与支原体种类和生长状况等有密切关系。螺旋丝状菌体的直径为(0.08~0.2)μm,长度为(2~5)μm,由于其直径小于光学显微镜分辨力,固然有长度,但在相差显微镜下不能观察到菌体;细丝状菌体的直径为(0.2~0.4)μm,长度可达100μm;球菌体横径为0.3μm,长径为(0.3~0.8)μm,固然球菌体的个体大于显微镜分辨力,但在相差显微镜下,仅可粗略地观察到菌体轮廓,不能分辨菌体的微细结构以及与寄宿细胞之间的结构关系。另外,患处分泌物混杂着局部组织或细胞的变性、退变及崩解产物。因此,仅仅从球菌体的粗略形态或菌体与细胞黏附状况,不能确诊为支原体。由于采用这种方法既可出现假阴性,也可出现假阳性。其诊断的可靠性值得怀疑。
  
  光学显微镜的有效
  
  放大倍数
  
  光学显微镜是依据可见光线透过介质后发生折射的原理,使物体放大到人眼可清楚见到的物体。由于光的波动性和显微镜各项技术参数如亮度、反差等因素的限定,目前,高档显微镜的有效分辨力遵循以下公式:
  
  有效分辨力=0.61×照明光线波长(λ)÷物镜数值孔径(NA)。
  
  相差显微镜常用单一波长绿色滤片,波长为550nm,高档油浸相差NA为1.25,其最高有效分辨力为0.27μm。
  
  显微镜的有效放大倍数=NA×1000
  
  按此公式可计算出,相差显微镜的最大有效放大倍数是1250倍,超过有效放大倍数为无效放大。其结果是,所观察到物体固然图像很大,但细节分辨不清,形成大而模糊的图像。另外,相差显微镜在观察透明的相位物体时,被观察物体与介质间形成“晕光环”,使在观察菌体时,降低了菌体表面的清楚度。再者,由于支原体小,又无胞壁,使得菌体的光程差小。
  
  相位物体的光程差(δ)=物体折射率(n)×物体厚度(e)。
  
  菌体的光程差小,使菌体与介质间及菌体内结构间产生的明暗反差小,因而降低了有效分辨力。无论用暗相差或亮相差物镜均会出现上述现象。
  
  电子摄像
  
  放大技术的效果
  
  电子摄影放大技术是将光学显微镜复式放大的虚像图像,再利用高分辨力的冷却液晶显示屏(CCD)摄像头,通过视频采集(或图像扫描),将摄取的图像经电子放大十几至几十倍,在显视屏幕上得到总放大倍数为原菌体几千至几万倍的图像。首先要明确地是,经光学显微镜放大的菌体虚像,再经电子放大不论多少倍,仍属无效放大,由于它并没有进步光学显微镜的有效分辨力,实际形成的图像仍为大而不清楚的模糊图像。通过电子视频放大,可以进步被观察菌体的明暗亮度反差,因而进步了一些清楚度。目前冷却CCD摄像头在1/2英寸上由150万个像素组成图像,一般显视屏图像可达580万个像素组成,即可将原摄取图像输出放大4倍。图像虽放大,但仍没有进步对物体的分辨力。
  
  综合以上三点分析,可以了解到,用相差显微镜附加视频放大,用来做临床支原体病原学诊断,是不适宜的,其结论也值得怀疑。

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